河流水生态环境质量监测与评价技术指南（征求意见稿）节选——水生生物监测
2020年生态环境部发布了《河流水生态环境质量监测与评价技术指南（征求意见稿）》，提出了用着生藻类（硅藻）评价水环境质量的标准方法，为水环境的生物评价增加了一项可靠的定量指标。该方法需要对500种不同的硅藻提供准确的鉴定，根据鉴定的结果对应每种硅藻的指示值和敏感值来评估水环境质量。但是，目前绝大部分地区的检测部门都无法独立完成如此精细的种类鉴定，深圳美恩美科技有限公司推出的硅藻电镜自动检测系统，可以全自动识别、分类、统计水中硅藻，代替人工完成种类鉴定任务。
水生生物监测
7.1 大型底栖无脊椎动物
7.1.1 设备及材料
7.1.1.1 采样器材和器具
7.1.1.1.1 D 型网（图 1A）：纱网为 40 目筛绢，用于采集处于游动状态的、在草丛、枯枝落叶和底泥表层的底栖动物，可用于定性或定量样品采集。
7.1.1.1.2 踢网（图 1B）：40 目筛绢，边长 1 m×1 m ，主要适用于底质为卵石或砾石且水深小于 1 m 的流水区定性或半定量样品采集。
7.1.1.1.3 索伯网（图 1C）：底边 50 cm（长）×50 cm（宽）×50 cm（高）或 25 cm（长）×25 cm（宽）×2 5 cm（高），网兜用 40 目的筛绢缝制，前者适用于深度小于 50 cm 的溪流或浅河定量样品采集，后者适用于深度小于 25 cm 的溪流或浅河定量样品采集。
7.1.1.1.4 抓斗采泥器（图 1D）：开口面积一般为 1/16 m2、1/12 m2 和 1/10 m2，用于水深大于 50 cm 的河流定量样品采集，其仅适用于软底质河床且水流较缓的区域。
7.1.1.1.5 篮式采样器（图 1E）：属于人工基质采样器，高 20 cm、直径 18 cm 的圆柱形铁笼，用 8 号和 14 号铁丝编织，孔径面积为 4～6 cm2，使用时，笼底先铺一层 40 目尼龙筛绢，再放上长约 8 cm 的卵石。用于水深大于 20 cm 的河流定量样品采集。
7.1.1.1.6 十字采样器（图 1F）：属于人工基质采样器，边长 40 cm，高 20 cm，中间十字分格，用铁丝编织或用塑料网包围，分别放入鹅卵石、水草、泥和沙。鹅卵石、水草下面放一层 40 目的尼龙筛绢铺底，泥、沙放入尼龙筛绢制作的网兜里，用于水深大于 20 cm 的河流定量样品采集。
7.1.1.1.7 防护工具：防水连靴裤（齐胸靴裤或防水长靴）、橡胶手套（长袖）、蚊帽、长探杆等；
7.1.1.1.8 测量工具：温度计、pH 计、溶解氧测定仪、米尺、GPS、测距仪、测深仪（或等效仪器）等；
7.1.1.1.9 样品收集及固定：铁锹、毛刷、白瓷盘、脸盆、塑料水桶、尖头镊子、40 目分样筛、标本瓶（30ml~100ml）、样品瓶标签、固定液、标准网格托盘（30 cm×36 cm，约 30 个 6 cm×6 cm 网格）等；
7.1.1.1.10 照相器具：照相机或摄像机等；
7.1.1.1.11 记录工具：记录纸、防水笔、底栖动物野外数据表等。
7.1.1.1.12 鉴定设备及器材：解剖镜、光学显微镜、培养皿、载玻片及盖玻片、尖头镊子、解剖针等。
7.1.1.2 试剂：5%甲醛，70%左右乙醇。
7.1.2 样品采集
7.1.2.1 溪流（可涉水河流）
7.1.2.1.1 定量采集
推荐使用 D 型网、索伯网、采泥器、人工基质篮式采样器或十字采样器。填写采样记录表，见附录C。
用D 形网采定量样品时，将 D 形网放置于河底，使D 形网的直边紧贴河流底部，逆水流方向从河流下游向上游移动一定距离（如 1 m），使样品随着搅动和流水的冲刷进入网内，根据生物密度大小确定采样面积。
用索伯网采样时，将网口正对上游，先用手刷将框内石块、树枝等基质上的样品顺水流方向刷入网中，其余部分用铁锹挖深 20 cm～30 cm，将框中的样品赶入网中。每个点位采集 4 筐，如果密度过低，应适当增加采样筐数。
用采泥器采样时，将采泥器打开，挂好提钩，将采泥器缓缓放至底部，然后抖脱提钩， 轻轻上提 20 cm，待两页闭合后，将其拉出水面，置于桶或盆内，用双手打开两页，使底质倾入桶内，经 40 目分样筛筛去污泥浊水后拣出样品。同一点位一般选择 3～5 个样点，每个样点采集 2 次～3 次。如果采泥器未完全闭合，需重新采集。
用人工基质篮式采样器采样时，采样点要选择采样断面上下一定范围内生境最好的（最具代表性）点位，以便表达出水质最佳（最具代表性）的状态。每个采样点至少放置两个采样器，两个采样器用 5 m～6 m 的尼龙绳连接，或用尼龙细绳固定岸边的固定物上，或用浮漂做标记。采样器安放的位置要考虑到流速和生境的不同，放置时间为 14d。取样时，采样器提出水面后，放置到白磁盘或盆里（以免采到的样品丢失）运到岸边，为了将人为的干扰或破坏降到最低，应避开走航、观光河流的主干道。如果在样品孵育期间发生洪水或冲刷等情况，待水体平稳后，重新安置人工基质。定期了解采样器材放置情况，如果样品丢失要及时补样。如果条件允许可以雇渔民看护。
用十字采样器采样时，采样器中分别放置不同的基质，方法与人工基质篮式采样器采集方法相同。
7.1.2.1.2 定性采集
推荐使用D 形网和踢网。填写采样记录表，见附录D。
用 D 形网采定性样品时，迎水站立，深水可以采用“弓”字采法，采集一定面积；浅水可一手将手抄网迎水插到底质表面并握紧，用另一只手将其前面 50 cm～60 cm 见方小面积上的石块等基质捡起，在手抄网前将附着的底栖动物剥离，以水流冲入网兜，然后用脚扰动底质，使底栖动物受到扰动，冲入网兜，持续大约 30 s。提起手抄网，转移采集的样品， 样点周边各种小生境均应采样。
用踢网采样时，一人将踢网正对上游展开并固定在水体底部，另一人用脚或手扰动网前1 m 的河床底质，利用水的流速将底栖动物冲刷入网。用踢网进行采样，移动性强的一些物种会向侧方游动而不被采获。一般采集 3～5 个样方，视样品量而定，记录采集样方个数。注 1：不同位置的样品：采样区域在采样点位上下 50 m 范围内，每个点位需要采集至少 3 次；采样人员应下水，在不同的基质上采集；采样范围应包括左右岸。
注 2：不同生境的样品：同一个点位要尽量采集石头、沉水植物、沙子、草丛、底泥等各种生境（对于生境复杂的样点，根据不同生境的比例进行采集，比如河道内石块占 50%，沙子占 20%，沉水植物占 30%）；单一生境采样可采用梅花布点、一字布点，还可以采用 S 形布点，样方的大小视环境而定，一般不少于 3 个样方；复合生境生采样要考虑到生境、水深、流速等要素进行布点。
注 3：不同流速的样品：要设主流（可涉）、浅滩、回水湾等不同流速的样点。
注 4：采集的顺序应该从下游至上游依次采集，避免上游采集时对下游采集点造成影响。
7.1.2.2 大型河流（不可涉水河流）
不可涉河流底栖动物的样品采集应结合点位的底质、水流、水深等环境条件确定相应的采样方法。
7.1.2.2.1 定量采集
软底质区域推荐使用抓斗采泥器，采样方法同 7.1.2.1.1；还可配合使用人工基质篮式采样器或十字采样器，采样方法同 7.1.2.1.1。
若采样点位于河岸处浅水区或可涉水湿地，定量样品的采集可参考 7.1.2.1.1 溪流及可涉河流方法。
7.1.2.2.2 定性采集
除用定量采样方法采集定性样品外，还可（但不限于）用三角拖网、D 形网、人工基质、徒手采样等方法采集定性样品，应尽可能在各种生境采样。
用三角拖网采样时，将拖网（带有重锤）抛入水中，在船上缓慢拖行（船速 2 节左右），至一定距离后提起拖网。将样品连同底质合并装入样品瓶中，贴上标签，带回实验室处理。
在一些特殊生境，如水中大型植物根部、倒木、大石块基部等采样点进行定性样品采集时，可使用 D 形网。在根株生境采样时，将 D 形网放在根株下游，用踢击的方法促使生物分离；在底质粗糙（混合砾石、卵石或大石块）生境采样时，可将 D 形网底部紧贴在底质上，踢击D 形网上游 0.5 m2～1 m2 范围内的底质，使生物从底质上分离，多次踢击后将样品合并；或者将 D 形网的直边紧贴河流底部，向前拖动 D 形网，使样品随着搅动和流水的冲刷进入网内。
7.1.3 样品挑拣与固定
在 40 目网筛中彻底冲洗样品，清除杂质和细小沉积物，直至水体澄清。冲洗大型有机物质（整片叶子、细枝、藻或大型水生植物根茎等）及杂质，肉眼检查无底栖生物后弃去。尽量现场挑拣样品，现场无法完成时，可加 5%甲醛或 70%左右乙醇保存固定，带回实验室进行挑拣。
一般情况下，样品中的生物个体需全部挑拣。但当某些种类生物数量极大时，可对该样品在混合均匀的情况下，采用网格法进行分样。分样前，应先随机取少量样品观察，根据该样品的生物数量预估分样量。分样时，必须将全部样品充分混匀，分样样品与剩余样品分开， 单独拣选并保存，以便进行质量控制检查。
需挑拣样品量不多时按二分法逐级减少取样量（如 1/2 样、1/4 样、1/8 样、1/16 样），使每份样中的较小型动物个体数量介于 20～50 个为宜，正常情况下拣出的生物总个体数应不少于 100 个。
需挑拣样品量极多且样品生物数量也极多则使用以下的基于 200 个个体的分样方案，也可使用其他分样大小（100 个、300 个或 500 个等）。
将冲洗后需分样样品放在带标记的标准网格托盘（见图 2）里均匀摊开。在实验室记录表中需注明大型生物或明显较多的生物，但不要将其从托盘中移走。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
1 | ||||||
2 | 36 cm2 | |||||
3 | ||||||
4 | ||||||
5 |
图 2 网格托盘示意图
随机选择网格托盘中的 4 个网格，移出所有材料（生物和残体），将其放入 4 个单独的白色搪瓷盘，加人少量水，便于拣选。如果大约（经粗略计数或观察）有 200 个（±20% ） 个体（4 格累积），分样即可完成。
压住网格线的个体，将其计入头部所在的网格。
如果无法确定其头部的位置（如蠕虫），则将其计入大部分身体所在的网格。如果生物密度足够高，4 个网格的生物体数量远远超过 200 个，再将这 4 个网格内的样品移到第 2 个网格托上。
按第一次的做法，随机选择网格，进行二级拣选，每次拣选一个网格，直至分样达到 200 个（±20% ）。
为避免肉眼挑拣造成某些小个体物种的遗漏，用肉眼和解剖镜相结合的方式进行挑拣。当分样挑拣时，逐份挑拣分样样品，当所选分样不断有形态大小各异的个体拣出时，需增加分样进行挑拣，直至没有新的形态大小各异的个体拣出，同时必须保证拣出的动物样本个数不小于 100 个，记录挑拣的分样份数。
挑拣出的样品可保存在加有少量 5%甲醛或 70%左右乙醇的广口瓶中。挑拣过程中发现小个体或罕见生物样本时，应单独分装保存，并予以记录。样品的挑拣以采样当天完成为最佳，当日挑拣工作出现中断时应将待挑拣样品置0～4℃冷藏保存，保存时间一般不超过24 h。
7.1.4 鉴定和计数
7.1.4.1 鉴定
样品应鉴定到尽可能低的分类单元，其中昆虫纲（摇蚊除外）、甲壳纲、蛭纲、多毛纲等应尽可能鉴定到科，寡毛纲、昆虫纲摇蚊科幼虫应尽可能鉴定到属，腹足纲、双壳纲应尽可能鉴定到种。鉴定过程中保留分类特征鉴定的照片凭证及标本。底栖动物分类鉴定主要参考检索资料（建议）见附录 E。记录下鉴定期间遇到的任何问题，填写实验室记录表，检查分样编号。
7.1.4.2 计数
记录下样品中发现的种类及数量，同时标明采样点位、时间、采样器材、种类鉴定的主要特征。所有底栖动物都按头部计数；软体动物的死壳不计数。
7.1.4.2.1 定量样品
实测个体总数量除以采样总面积（或人工基质笼的总数），即可得该种类的栖息密度（ind/m2 或 ind/笼）或生物量（g/m2）。
7.1.4.2.2 定性样品
采集的样品中同一种类个体数在 1～9 个之间计“＋”，表示“出现”；在 10～29 个之间计“＋＋”，表示“多”；大于 30 个计“＋＋＋”，表示“很多”。
7.1.4.3 结果计算与表达
某一种（类）的个体密度（ind/m2 或 ind/笼）或生物量（g/m2）按照公式（1）计算：
式中，Di——i 种的个体密度，ind /m2 或 ind/笼；
Bi——i 种的生物量，g/m2；
di——i 种的计数个体数，ind；
bi——i 种的重量，g；
Ac——挑拣分样数（二分法为 1/2 等，网格法为 4/30 等），无单位；
A——采样面积，m2。
采样点位（断面）大型底栖无脊椎动物总个体密度和生物量（ind /m2）按照公式（2） 计算：
式中，D——采样点位（断面）总个体密度，ind /m2； B——采样点位（断面）总生物量，g/m2； Di——i 种的个体密度，ind /m2；
Bi——i 种的生物量，g/m2；
N——总分类单元数，个。
通过结果计算在底栖动物计数记录表（附录 F）填写该种类的个体密度、生物量。
7.1.5 样品保存
鉴定后的底栖动物样品按点位和日期归类放置在加有 5%甲醛或 70%左右乙醇的广口瓶中，封住瓶口。定期检查补充保护剂。在广口瓶外侧附可黏贴标签，标明样品识别码、日期以及防腐剂。将永久性标签附于标本瓶内外侧，附以下信息：水体名称、点位编号、日期、采集人姓名、防腐剂类型。原则上样品至少保留 4 个月，有条件的实验室可长期保存。
7.1.6 结果填报
现场定量和定性采样填写现场记录表附录 C 和附录 D。各点位的数据整理后填写在鉴定结果表格附录 F 中。
7.2 着生藻类
7.2.1 设备及材料
7.2.1.1 野外采集器材
7.2.1.1.1 采集与处理器材
不锈钢勺、牙刷、镊子、抹刀、刀片、剪刀、硅藻计、载玻片、托盘、一端带胶圈的PVC 管、吸盘或吸管、洗瓶（装蒸馏水用）、培养皿、带冰块的冷藏箱、丙烯酸缆绳、铝箔、500 mL 样品瓶、透明胶带。
7.2.1.1.2 记录工具
记号笔、铅笔、标签纸、采集记录本。
7.2.1.1.3 实验室保存和鉴定器材
配备 10×、20×、40×、100×（油镜）物镜及 10×、15×目镜的相差或微分干涉显微镜、浮游生物计数框、载玻片、盖玻片、电热平板、镊子、200 μl 移液枪、酒精灯，恒温水浴锅，胶头滴管，1.5 ml 离心管、防酸手套、护目镜、防护服、通风橱、纱布等。
7.2.1.2 固定和前处理试剂器材
7.2.1.2.1 样品固定试剂
鲁哥氏液（60 g 碘化钾溶于少量水中，再加入 40 g 碘，待碘溶解后定容至 1000 mL）；福尔马林（市售 40%甲醛溶液）。
7.2.1.2.2 硅藻前处理器材及试剂
酒精灯、胶头滴管、移液枪、枪头、烧杯、天平、试管、试管夹、试管架，1.5 ml 离心管、记号笔、白胶布、剪刀，镊子、防酸手套、乳胶手套，离心机、离心管及震荡器，条件具备可以用CEM Mars 微波消解仪等。
浓盐酸（95%～98%）、浓硫酸（98%）、浓硝酸（65%～68%）、双氧水（30%）、75％酒精及蒸馏水等。
7.2.1.2.3 藻类封片器材及试剂
载玻片、盖玻片（20×20 mm）、胶头滴管、加热板、标本盒、砖石笔、镊子、Naphrax胶（折射率 1.703）或加拿大树胶；二甲苯或甲苯；蒸馏水等。
7.2.2 野外采样程序
7.2.2.1 采样点设置
着生藻类的采样点位应尽量与底栖动物以及常规理化监测采样点位保持一致。
7.2.2.1.1 溪流（可涉河流）
一般情况下溪流着生藻类的采样点位与底栖动物及常规理化监测采样点位应保持一致。
7.2.2.1.2 大型河流（不可涉河流）
通常在目标河段上通过 GPS 以 50 m 为间隔，设置 11 个横断面。选择低潮线附近的岸边以及 0.3 m 等深线附近的河边作为着生藻类样品采集区域。为避免受到人为活动干扰，尽量选择在河段上游区域采样，远离排污口、大坝等。若采集现场无可用基质或出于安全考虑无法完成采集时，可对个别采样点位置进行修改。考虑到大型河流水体的相对稳定性、气候及着生藻类的生态特点，采样时间优先选择每年的 7 月初至 9 月底。也可根据实际要求按不同水期采集（例如，亚热带河流通常选择枯水期采样）。
7.2.2.2 样品采集
7.2.2.2.1 定量样品的采集
着生藻类定量样品采集，一般选择硅藻计法。
采样器材的固定应避开溪流中的急流和漩涡。硅藻计可以与底栖动物的篮式采样器相连，通过调节绳子的长短，保证硅藻计距离水面 5 cm～10 cm，也可以参照 GB/T 12990 的挂放方式放置采样器材。为避免丢失，每个采样点至少放置 2 块人工基质。要求尽量将人工基质隐藏，避开走航、观光河流的主干道。定期了解着生藻类建群情况，如采样前发生洪水或冲刷等情况，待水体平稳后，需重新安置人工基质，如样品丢失应及时补样。条件允许可以雇渔民照看，放置时间至少 14 d。取样时填写采样记录表（附录 G）。
因大型河流水流湍急无法固定采样器材时，可根据现场情况选择容易刮取和测量的天然基质，如粗砾石、鹅卵石以及树木残干等，从其表面刮取一定面积的样品进行定量分析。将采集的基质放置于漏斗中，用牙刷刷取基质表面 5 cm×5 cm 的面积，用蒸馏水或纯净水冲洗牙刷，使用样品瓶收集冲洗混合物。若基质无法从水体取出，使用刀片或镊子刮取基质表面 5 cm×5 cm 的面积，用蒸馏水或纯净水冲刷刀片或镊子，收集冲洗混合物进样品瓶。若样点内无硬基质，则使用注射器（或吸管）吸取 25 cm2 的松散基质，如：细砂、淤泥及黏土等，收集至样品瓶中。此外，也可将培养皿压入松散基质中，并在其下方滑动抹刀，将采集到的松散基质从培养皿中取出，收集至样品瓶中。将采集到的样品混合在样品瓶中，加入蒸馏水或纯净水至样品瓶 2/3 处，立即放入 4℃冰箱或在样品瓶周围加冰并避光保存。若样点为硬质底质或细砾石，可在采样点上下游 5 m 范围内寻找合适的基质取样或选择墩、码头等代替。出于安全考虑无法完成采集的样点，可放弃该样点的着生藻类采集，并在着生藻类现场采样记录表中做好记录。
7.2.2.2.2 定性样品的采集
定性样品采集通常使用天然基质法。采集所有生境（浅滩、急流、浅池、近岸区域）不同基质上的着生藻类样品，将所有样品混合装入样品瓶中，贴上临时标签（临时标签可以只标注样品号或一次采集的统一编号）（见表 1）。
表 1 着生藻类采集技术
基质类型 | 采集技术 |
砂砾、卵石、圆石及 树木残骸 | 将基质从水中缓慢移出，将表面较为光滑和略带绿色、蓝绿色或棕黄色的部分用牙 刷或小刀刮取到装有蒸馏水的样品瓶中 |
苔藓、大型藻类、维 管植物及根块 |
刮取表面滑腻的部分放入样品瓶，加少量蒸馏水 |
大块岩石、河床岩石、 原木及树木 | 将一端带有胶圈的PVC管固定在基质上，使其紧密相接。用牙刷或刮刀将基质上的 藻类直接刮下，用水冲洗入PVC管，用吸管将藻类吸入样品瓶中 |
沙子、淤泥和黏土等 松散基质 | 用培养皿压入松散基质中，并在其下方滑动抹刀，将培养皿中采集到的松散基质冲 洗到样品瓶中。此外，也可使用勺子及吸管等采集 |
注：若采集地点没有可以采集的基质，建议使用 25 号浮游生物网对水体的浮游生物种类进行定性采集，以获取较为丰富的种类类群。
7.2.2.3 样品的固定与保存
7.2.2.3.1 定性样品固定：按 5%比例加入鲁哥试液，如需长期保存需加入 3%甲醛溶液。
7.2.2.3.2 定量样品固定：按 5%比例加入鲁哥试液，鉴定完成后如需长期保存加入 3%甲醛溶液。
7.2.2.3.3 样品保存：在样品瓶外贴好标签，标明采样点信息、采样日期以及样品体积等。用透明胶带粘贴于标签外层，以防止标签脱落。将样品置于样品柜中密封并避光保存。
7.2.2.4 标识与记录
7.2.2.4.1 标识：标签需标注采样地点、站位编号、日期、采集人姓名、固定液类型。
7.2.2.4.2 记录：在野外记录本或着生藻类采样记录表中记录下河流名称、采样位置、点位编码、采样日期、采集人姓名、采样方法及相关的生态信息，建立电子档案保存。
7.2.3 实验室分析
7.2.3.1 定性样品
7.2.3.1.1 非硅藻样品
1） 预处理：
方法一：常规制片法
将采集到的样品根据其样品中个体密度适当沉淀、浓缩至适宜体积，观察时，将样品充分摇晃均匀后静置 5～10 s，用移液枪吸取液体中间略偏下位置的样品滴放到载玻片上，制成临时装片鉴定、计数。
注：由于着生样品中多含有大量的泥沙，泥沙的重量普遍大于藻类，需静置使其迅速沉淀至样品瓶底， 以减少大量杂质对鉴定造成的干扰，静置的同时会导致藻类轻微沉降，所以吸取液体中下部的样品。
方法二：甘油制片法
甘油封片法：
①配置甘油封片试剂：按照甲醛：甘油：蒸馏水的体积比为 4：10：86 配置甘油封片试剂；
②按照一份（滴）样品加两份（滴）甘油封片试剂的比例置于载玻片上；
③待蒸馏水挥发后（根据室温、湿度条件不同有一定的差异，一般为 24 h）补充封片试剂一次（两份/两滴）；
④待蒸馏水再次挥发后盖上盖玻片置于显微镜下进行鉴定，使用时间与外界条件有关，一般为 2 d～3 d。
注：由于接触生物监测时间较短的人员开展种类鉴定较为困难，而受空气、光源等因素影响，临时装片样品中的水分可能快速挥发，影响对样品的观察。因此也可以将样品制成甘油封片，减少鉴定中因外界因素产生的困难。
2） 种类鉴定
将样品装片置于 10×40 倍显微镜下观察鉴定至属或种。推荐采用的鉴定参考资料见附录 E。
7.2.3.1.2 硅藻样品
（1） 预处理
硅藻种类的形态学鉴别主要依据其纹饰和壳体形状，因此，在鉴定之前，首先要进行样品预处理去除硅藻细胞中的原生质，仅保留主要带花纹和纹饰的硅质外壳。检测人员可根据实验室情况从以下两种推荐方法中选择合适的方法进行硅藻样品的预处理。
方法一：三酸法
根据样品藻密度酌情吸取 15～20 ml 样品置于离心管内，1500 r/min 离心 8 min；弃去上清液，保留沉淀（1～2 ml）；（以下步骤需在通风橱中进行）
①用试管夹夹住试管在酒精灯上加热，至标本中的液体全部蒸发；
②加入 3～4 滴浓盐酸继续加热，至颜色变深，液体大部分蒸发；
③加入 2～4 滴浓硫酸加热，至试管中的液体逐渐变黑，并产生大量气泡；
④加热直至试管中的液体变为炭黑色，不再产生气泡并伴有白色气体冒出；
⑤加入 2～3 滴浓硝酸，此时反应剧烈并伴有响声，有大量棕红色气体冒出；
⑥继续加热直至沉淀物变为淡黄色或无色，气体变为白色。方法二：微波硝酸消解法
①摇匀硅藻样品，吸取 10 ml 至离心管内，1500 r/min 离心 8 min，去上清液后将离心管内的沉淀物转至消解管内（如果野外采集的标本里有水草、苔藓等移液枪不能吸取的物质， 首先震荡标本瓶，尽可能使附着在这些基质上的硅藻脱落，然后在吸取完 10 ml 液体以后， 再用镊子镊取少许水草、苔藓等基质入消解管等待下一步处理）；
②在消解管内加入 10 ml 浓硝酸，盖好消解管的内外盖后放入消解仪内，选择 180℃程序消解 2 h（消解过程中应将与消解仪连通的通风厨打开）；
③待消解完成后，在通风厨下打开消解管盖使其冷却，冷却后的样品转移到容量为 15 ml
的离心管内。
（2） 处理后样品的洗涤
将预处理后的样品以 3000 r/min 的速度离心 5 min，用胶头滴管弃去上清液，保留沉淀物，加入蒸馏水反复冲洗后再次离心。整个过程重复 5～7 次。
（3） 处理后样品的保存
最后一次离心结束后，用移液枪小心移去上清液，尽可能移取干净，然后在离心管内加入 0.5 ml 无水乙醇，用移液枪摇匀后将样品转移至 1.5 ml 的离心管中，用无水乙醇清洗几次离心管，尽可能将所有样品都转移到离心管中，贴好样品标签，放入标本盒保存。由于酒精具有挥发性，需要每隔一段时间补充酒精。永久封片制作方法如下：
方法一：加拿大树胶封片
①用二甲苯浸泡加拿大树胶，使其变为粘稠状的液体（大约需要两周的时间）；
②将载玻片和盖玻片洗净、擦干，放到一旁保持干燥；
③摇晃装有干净标本的微型离心管，使标本沉淀与酒精均匀混合成悬浊液；
④用移液枪吸取 10 μl～20 μl 硅藻的悬浊液，滴在盖玻片上并涂匀，放在热平板（60℃～
70℃）上干燥；
⑤在载玻片中间滴一滴泡好的加拿大树胶，将盖玻片涂有标本的一面向下盖在胶上，使胶慢慢散开，接近或完全扩散到整张盖片上；
⑥用记号笔在载玻片上做好标记，防止混乱，室温干燥；
⑦封片完全干燥后（大约需要 3 d～4 d），即可观察；
⑧待一次样品封片全部制作完毕后统一制作、粘贴标签。方法二：Naphrax 胶封片
①用甲苯浸泡Naphrax 胶，使其达到合适的粘稠度；
②将载玻片和盖玻片洗净、擦干，放到一旁保持干燥；
③摇匀装有干净标本的微型离心管，使标本沉淀与酒精均匀混合成悬浊液；
④用移液枪吸取 10 μl～20 μl 的悬浊液，滴在盖玻片上涂匀，放在热平板上干燥；
⑤在载玻片中间滴一滴泡好的Naphrax 胶，将盖玻片涂有标本的一面向下盖在胶上，使胶慢慢散开，接近或完全扩散到整张盖片上；
⑥将载玻片放在 150℃～160℃的加热板上加热 3 min～5 min，使封片胶充分液化且气泡完全被排出（将甲苯挥发完）；
⑦用记号笔在载玻片做好标记，防止混乱，待封片冷却干燥后即可观察；
⑧待一次样品封片全部制作完毕后统一制作、粘贴标签。
（4） 种类鉴定
将藻类封片样品置于 10×100 倍油镜（含 DIC 相差功能的显微镜）下观察，样品尽量鉴定至属及以下。对于光学显微镜下形态特征难以鉴定的种类，可通过扫描电子显微镜进行鉴定。
扫描电子显微镜观察标本的准备方法如下：
在铜制样品台上贴上导电胶，在胶上贴上圆形盖玻片，滴上 5 μl～10 μl 处理后的标本， 自然干燥。标本干燥后，在真空条件下喷金 3 min，即可观察鉴定。
种类鉴定推荐鉴定参考资料见附录 E。
7.2.3.1.3 结果记录
鉴定、计算后填写定性鉴定记录表（见附录 H）。
7.2.3.2 定量样品（沉降计数法）
7.2.3.2.1 藻类预处理
选用合适的器皿，尽量减少样品转移的次数，将着生藻类样品浓缩、沉淀后，定容至20 ml～50 ml（根据不同样品中生物个体的密度调整定容的体积）。将浓缩样品充分摇晃均匀后，取 0.1 ml 置于浮游生物计数框中（图 3）鉴定计数。
图 3 浮游生物计数框
7.2.3.2.2 藻类鉴定
在 10×40 显微镜下，将藻类鉴定至属或种级分类水平，其中优势种要求鉴定到种。如有大量硅藻出现，建议按照定性样品中对硅藻的处理方法进行封片，在 10×100 的显微镜下进行鉴定，用此结果对 10×40 倍镜的鉴定结果进行校正。
7.2.3.2.3 藻类计数
（1） 长条计数法
选取两相邻刻度从计数框的左边一直计数到计数框的右边称为一个长条。与下沿刻度相交的个体，应计数在内，与上沿刻度相交的个体，不计数在内，与上、下沿刻度都相交的个体，以生物体的中心位置作为判断的标准，也可在低倍镜下，按上述原则单独计数，最后加入总数之中。一般计数三条，即第 2、5、8 条（如图 4A 所示），若藻体数量太少，则应全片计数。
（2） 对角线计数法
对于刚开始从事生物监测工作的人员，在长期鉴定计数中，推荐对计数框中的样品按照对角线进行计数（如图 4B 所示），每 0.1 ml 样品计数 5 或 10 个小格，重复计数多次，共计数 30 个小格。
对丝状体和一些较小的群体，可以先计算个体数，然后求出该种类个体的平均细胞数， 对于群体，可通过加热、超声波振荡等方法使其散开成为单个细胞或少数细胞的群体，进而完成计数。
（3） 硅藻的计数
若需要对硅藻群落进行精细分析，可在硅藻封片中计数 400～600 个硅藻壳面（羽纹纲硅藻一个完整的藻体由两个壳面组成，中心纲硅藻链状由两个壳面组成），计算每个种类的相对丰度，以此分析群落组成情况。
注：当硅藻细胞严重损坏（损坏超过 3/4），上下壳面完全分离以及空无纹饰时不计数。
7.2.3.2.4 结果计算
样品中单位面积藻类的个体数量 n（cell/cm2）按照公式（3）计算：
式中，n——单位面积藻类个体数量，cell/cm2；
ni——抽样的总个体数量，cell； V——抽样体积，ml；
Vi——定容总体积，ml； S——采样总面积，cm2。
7.2.3.2.5 结果记录
鉴定、计算后填写定量鉴定记录表
