利用数字全息显微镜对液体中的硅藻进行自动分类

Memmolo, P.; Carcagnì, P.; Bianco, V.; Merola, F.; Goncalves da Silva Junior, A.; Garcia Goncalves, L.M.; Ferraro, P.; Distante, C. Learning Diatoms Classification from a Dry Test Slide by Holographic Microscopy. Sensors 2020, 20, 6353. https://doi.org/10.3390/s20216353

硅藻是海洋和淡水栖息地的主要浮游植物之一，也是水质的重要生物标志物，使其识别和分类成为当前环境监测的挑战之一。深度学习被认为是解决图像分类问题的可选技术。然而，这通常需要大量的训练数据，因此需要通过数据增强对数据集进行综合放大。

任何先前关于硅藻物种分类的研究都需要专家硅藻学家进行数据集标记和每个类别的大量训练数据。由于微藻种群的巨大异质性，对称为区分数千种不同物种的网络进行详尽的训练是一项不可行的任务。然而，包含各种硅藻种类的测试载玻片在市场上变得越来越容易获得。这些通常由专业海洋生物学家为分类目的准备，将每个物种的元素并排放置在两个载玻片之间。活硅藻用于此范围，同时确保保留其形态和叶绿体含量。如果对物种进行了适当的选择，这种载玻片可以被认为是可以在一定部分海水中找到的种群库，并可能在未来成为海洋栖息地的一种指纹。

数字全息显微镜（DHM）是数字全息技术在显微领域的应用，也被称为全息显微术。与其他显微技术相比，数字全息显微镜并不直接记录被观测物体的图像，而是记录含有被观测物体波前信息的全息图，再通过计算机对所记录的全息图进行数值重建来得到被测物体的相位和振幅（光强）信息，进而完成数字三维重构。打个形象的比方来理解数值重建这个过程，就是利用计算机算法代替传统光学显微镜中的成像透镜。

在这里，我们展示了这样的测试载玻片对于训练准确的深度卷积神经网络 (CNN) 非常有用。我们展示了基于适当的 CNN 集合和完全增强的数据集的硅藻的成功分类，即从包含 50 个固定类别的商业载玻片在干燥环境中的每个类别的单个图像开始创建。这种方法避免了由熟练的海洋生物学家进行水采样和标记的耗时步骤。为了实现这一目标，我们利用数字全息显微镜，由于其固有的 3D 成像能力，它允许访问定量的相位对比图和后验灵活的重新聚焦。然后通过使用在水样中成像的活硅藻的全息记录来验证网络模型，即在它们的自然潮湿环境条件下。

我们测试了 13 种架构，并根据测试阶段达到的分类准确度对它们进行了排名。为此目的，已经考虑了形态相似的物种。我们选择了准确率高于 90% 的三种架构，并实施了最大投票集成标准。特别是 SE-ResNET50，已发现 EfficientNET-B0 和 EfficientNET-B1 克服了选定的准确度阈值，并且这三个模型的集成在区分三个形态相似的种群方面达到了 98% 的准确度。从一方面来看，这个结果显示了我们考虑的 DCNN 的高泛化能力。此外，很明显，即使在用于训练的数据高度相关的这种具有挑战性的情况下，不同模型的适当集合也可以提高分类性能。

在这个框架中，由于其灵活的聚焦能力，全息显微镜的使用至关重要。事实上，当硅藻悬浮在液体中时，它们在 3D 体积中占据不同的位置。因此，对于选定的采集平面，只有少数对象被聚焦成像。在传统的光学显微镜中，需要机械聚焦扫描来恢复每个物体的焦点，这在寻找最佳聚焦条件时可能会出错。因此，自动 DH 重新聚焦对于在失焦捕获后获得所有物体的后验焦点，而与它们的位置无关是必不可少的。在流动样品的情况下，例如，在用于高通量环境监测应用的成像流式细胞仪中，灵活的 DH 重新聚焦更为重要。

此外，一旦重建全息图，就可以获得对象的复振幅。因此，访问如此丰富的信息源使分类器在引入新物种时更加稳健，并允许处理更困难的分类问题。原则上直接使用失焦图像训练网络是可能的，并将成为进一步研究的对象。此外，自动对焦过程本身可以通过使用预先训练的网络快速执行，从而加快整体处理速度。